大家好,今天小编来为大家解答以下的问题，关于酵母基因组DNA 的提取，这个很多人还不知道，现在让我们一起来看看吧！

（2）掌握酵母基因组DNA提取的方法和操作流程。

（3）熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的操作流程。

【实验原理】酵母是单细胞真核生物，细胞膜外有细胞壁。提取酵母基因组DNA的关键是破坏细胞外的细胞壁。酵母裂解酶（Zymolyase）或壁面酶具有酵母细胞壁酶的活性。该方法使用解旋酶处理去除酿酒酵母的细胞壁。用SDS 溶液处理脱壁的酿酒酵母细胞，使细胞破裂，使蛋白质变性，并释放基因组DNA。然后在低温下用醋酸钾溶液处理，使基因组DNA 完全复性并将其溶解在水中。最后通过乙醇沉淀获得基因组。脱氧核糖核酸。该方法避免了苯酚、氯仿等有机溶剂的使用，使操作更加简单、安全。

【实验材料、试剂、仪器】

1、实验材料酿酒酵母菌株CJY151（也可以是其他酿酒酵母菌株）。

2. 实验试剂

(1)YPD培养基：1%酵母抽提物、2%蛋白胨、2%葡萄糖，低温灭菌20分钟。

(2)20mg/mL Zymolyase(酵母裂解酶)溶液：购自日本Seikagaku公司或美国Sigma公司。 (3)溶液A：1mol/L山梨醇，100mmol/L EDTA(pH 8.0)。

(4)溶液B：250mmol/L EDTA(pH8.0)、400mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、2%SDS。

(5) 5mol/L KAc溶液：将49.1g醋酸钾溶解于100mL去离子水中，4保存。

(6)无水乙醇。

(7) 70%乙醇：用无菌水将70mL无水乙醇稀释至100mL。

(8) 含10 g/mL RNase A 的TE 缓冲液：10 mL TE 缓冲液[10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、1 mmol/L EDTA (pH8.0)，121高压灭菌20 分钟，备用]添加10 L 10 mg/mL RNase A 溶液。

(9) TE缓冲液(pH7.5)：10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、1mmol/L EDTA(pH 8.0)，121高压灭菌20分钟，备用。

(10)琼脂糖凝胶电泳相关试剂。

3实验仪器

台式高速离心机（每8人1套） 恒温水浴锅（每8人1套） 1.5mL无菌离心管（每人4支） 移液器（每2人1套） 1mL、200L无菌吸头（每人10支） 吸水纸（每4人1卷） 琼脂糖凝胶电泳相关设备

【实验步骤】

(1) 将酿酒酵母接种于5 mL YPD 液体培养基中，30振荡培养36 小时以上，取菌液1.5 mL，10000 r/min 离心2 分钟，收集细胞，弃去上清液。

(2) 加入500 L A溶液，摇匀。

(3)加入3L 20mg/mL Zymolyase溶液，37孵育1小时，5000r/min离心2分钟，弃上清。 (4) 加入400 L TE buffer (pH 7.5)，吹打混匀，5000 r/min 离心2 min。丢弃上清液。

(5) 将细菌重悬于350 L TE 缓冲液(pH7.5) 中。

(6)加入90L溶液B，65水浴30分钟。

(7)加入80L 5mol/L KAc溶液，4静置2小时，然后4、12000r/min离心5分钟。

(8) 将上清液转移至1 mL无水乙醇中，4、12000 r/min离心5 min，弃上清液。

(9) 用0.4 mL 70%乙醇洗涤沉淀一次，4、12000 r/min离心5 min，弃上清。

(10) 用40 L无菌水溶解沉淀，备用。

(11) 如果需要去除产品中的RNA，请加入适量含10 g/mL RNase A的TE buffer，处理1小时。

(12)取10L样品进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

【实验笔记】

【典型实验结果分析】 1、理想的实验结果（见图5.2，泳道1）是DNA分子大于23kb，条带清晰，可直接用于后续分子生物学操作。如果不去除RNA，凝胶前端会出现大量RNA 条带。由于RNA的存在并不影响后续的分子生物学操作，因此在酵母基因组DNA提取过程中可以省略此步骤。

图5.2 酿酒酵母基因组DNA 1M：DNA分子大小标准参考物质琼脂糖凝胶电泳结果； 1~2：酿酒酵母基因组DNA（RNA未去除）

图5.3 酿酒酵母基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果2

M：DNA分子大小标准参考物质； 1~2：酿酒酵母基因组DNA，均出现一定程度的降解，其中1孔降解程度较严重2.典型实验结果1（见图5.3，泳道2）DNA分子大小正常，条带清晰，但条带亮度较弱，说明DNA量较少。解决方案：增加大肠杆菌细胞数量并重新提取。

3典型实验结果2（见图5.3，泳道1）条带弥漫且模糊，严重时可能出现阶梯状条带，表明获得的基因组DNA被降解。常见原因包括：手术过程中过度运动，导致基因组DNA断裂；用于去除RNA 的RNase 与DNase 混合。解决方案：重新提取DNA，