老铁们，大家好，相信还有很多朋友对于打造高效噬菌体筛选与推荐流程和的相关问题不太懂，没关系，今天就由我来为大家分享分享打造高效噬菌体筛选与推荐流程以及的问题，文章篇幅可能偏长，希望可以帮助到大家，下面一起来看看吧！

1. RNA提取：将Trizol保存的外周血淋巴细胞转移至1.5 mL离心管中，加入1/5体积的氯仿，混匀；室温静置5分钟，然后4度12000g离心15分钟；小心离心，将上清液转移至新的离心管中；在新离心管中加入0.5-1倍体积的异丙醇；室温静置10分钟，然后4度12000g离心10分钟；用与Trizol中保存的外周血淋巴细胞等体积，用75%乙醇洗涤沉淀，4度7500g离心5分钟，并溶于适量的无RNase水。

2.反转录cDNA：按照反转录试剂盒的说明，将上一步得到的RNA反转录成cDNA。

3. 扩增抗体片段：使用Taq DNA 聚合酶热启动酶进行PCR 扩增，从反转录的cNDA 中扩增特异性抗体片段。

PCR反应体系为：cDNA模板2ul，ALPVH-C引物2ul，CALL002引物2ul，10X Taq Buffer 5ul，dNTP 4ul，Taq(HS)0.25ul，ddH2O补至50ul。 PCR反应条件为：98度3分钟； 95度30秒，57度30秒，68度40秒，每个循环增加2秒，重复22个循环； 68度5分钟。将获得的PCR扩增产物进行琼脂1%脂肪凝胶电泳。您可以看到两条带，一条大约1.0kb，一条大约0.7kb。使用天根DNA纯化回收试剂切割0.7kb条带的凝胶。盒子按照说明进行回收。

从先前PCR 步骤扩增和回收的DNA 片段中再次扩增特异性抗体片段。使用Taq DNA Polymerase Hot Start Version 酶进行PCR 扩增。 PCR反应体系为：DNA模板2ul，Rvhh-FP引物2ul，Rvhh-RP引物2ul，10X Taq Buffer 5ul，dNTP 4ul，Taq(HS)0.25ul，加入ddH2O至50ul。 PCR反应条件为：98度3分钟； 95度50秒，55度30秒，72度40秒，重复12个循环； 72度10分钟。根据说明书使用DNA纯化和回收试剂盒回收获得的PCR扩增产物。

4.克隆进噬菌体质粒：用BglI酶消化上一步扩增的抗体基因序列和噬菌体载体。酶切体系为：扩增基因12ug或载体3ug，10X BglI Buffer 3ul，BglI 4.5ul，加水至30ul。酶消化在37度下进行3-4小时。酶切后，使用DNA纯化回收试剂盒按照说明书回收载体并扩增基因，然后进行连接反应。连接反应体系为：200ng载体、80ng扩增基因、2ul T4连接酶、5ul 10X连接缓冲液，加水至50ul。 4反应过夜。按照说明书使用DNA纯化回收试剂盒回收连接产物，并溶解于超纯水中。

5.改造SS320：将电穿孔杯置于冰上预冷。 SS320感受态细胞融化后，加入1ul回收的连接产物。将混合好的感受态细胞和连接产物转移至预冷的电穿孔杯中。使用电穿孔仪预设的细菌转化程序对细胞进行电穿孔。电穿孔后立即将1 mL SOC 培养基添加到电穿孔杯中。将细胞在37度复苏60分钟，然后将其铺在含有四环素和氨苄青霉素抗性的LB培养板上过夜生长。

上一步过夜生长后，用LB培养基和包被棒冲洗并刮擦培养板上的细胞。添加20%甘油，-80度保存。

6. 扩增纯化噬菌体文库：将上一步刮取的约10^9个细胞转移至100mL预先添加四环素和氨苄青霉素抗生素的2X YT培养基中，37度220rpm培养至OD600达到0.5。按辅助噬菌体：细菌细胞数20:1 的比例添加辅助噬菌体，并在37C 下继续培养30 分钟。添加终浓度的卡那霉素和0.2mM IPTG，并在30C 下孵育过夜。

将培养过夜的细胞以13,000 rpm、4 度离心5 分钟。将上清液转移至新的离心管中，加入1/4体积的预冷的5X PEG8000/NaCl，并在冰上孵育30分钟。 4 度、13,000 rpm 离心10 分钟，除去上清液，加入1 mL PBS 缓冲液溶解沉淀。再次添加250ul 5X PEG8000/NaCl，并在冰上孵育10 分钟。 4 度、16000g 离心15 分钟。除去上清液，将沉淀溶解于1mL PBS中，获得噬菌体文库。

关于打造高效噬菌体筛选与推荐流程到此分享完毕，希望能帮助到您。